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前言

宮頸癌是一種嚴(yán)重危害女性健康的惡性腫瘤。根據(jù)國家癌癥中心統(tǒng)計(jì)的數(shù)據(jù)，2022年我國宮頸癌新發(fā)15萬例，死亡5.5萬例，發(fā)病例數(shù)和死亡例數(shù)都超過了其他婦科腫瘤的總和^[1]。早期宮頸癌（≤IB2期）通常通過手術(shù)治療，2年復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)為8%-10%；晚期采用放化療，2年復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)為30%-50%。對于接受過浸潤性宮頸癌治療的女性，定期進(jìn)行常規(guī)臨床檢查，必要時(shí)進(jìn)行輔助影像學(xué)檢查，例如磁共振成像（MRI）或計(jì)算機(jī)斷層掃描（CT）。然而，目前尚無可靠的監(jiān)測標(biāo)志物來預(yù)測哪些患者在宮頸癌治療后更有可能復(fù)發(fā)，血漿游離腫瘤HPV（HPV ctDNA或ctHPV）是一種潛在的生物標(biāo)志物^[2]。

ctHPV和分子殘留病灶檢測

HPV是一種嗜上皮組織的無包膜雙鏈環(huán)狀小DNA病毒，病毒基因組約8 kb，可分為3個(gè)區(qū)域：早期基因（包含開放閱讀框E6、E7、E1、E8、E2、E4、E5，4.5kb）、晚期基因（包含開放閱讀框L2和L1，2.5kb），以及非編碼上游調(diào)節(jié)區(qū)（URR）又稱為長控制區(qū)（LCR，1kb）。HPV基因組序列存在10%以上的不同，即為不同的基因型別。目前已發(fā)現(xiàn)并分離鑒定出200多種HPV型別，并按其誘發(fā)癌癥的潛力，分為高危型與低危型。其中HPV16/18型占比約70%^[3]。

▲HPV病毒基因組結(jié)構(gòu)和電鏡下的HPV分子^[4]

E6和E7是與宮頸癌關(guān)聯(lián)最緊密的致癌基因。在高危型HPV（hrHPV）持續(xù)感染期間，HPV DNA通常會(huì)整合到宿主基因組中，其負(fù)調(diào)節(jié)因子E1和/或E2被破壞，導(dǎo)致病毒癌基因E6和E7表達(dá)失調(diào)^[5]。E6和E7蛋白分別與p53和pRb結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞中抑癌蛋白水平顯著降低，宿主染色體不穩(wěn)定，DNA的復(fù)制出現(xiàn)紊亂而誘發(fā)腫瘤^[2]。也有研究通過Nanopore分析HPV16型的整合方式，發(fā)現(xiàn)有部分病毒E6/E7并未整合到基因組中，但占比很低^[5]。

分子殘留病灶（MRD）是指經(jīng)過治療后，傳統(tǒng)的影像學(xué)檢查或?qū)嶒?yàn)室檢測方法不能發(fā)現(xiàn)，但通過細(xì)胞分子生物學(xué)方法在血液等液體活檢中發(fā)現(xiàn)的腫瘤來源分子異常，提示腫瘤細(xì)胞持續(xù)存在或臨床進(jìn)展可能。ctDNA是指主要來源于原發(fā)腫瘤、轉(zhuǎn)移灶或循環(huán)腫瘤細(xì)胞等釋放到循環(huán)系統(tǒng)中的腫瘤基因組片段，其攜帶腫瘤特異性遺傳或表觀遺傳變異，可實(shí)時(shí)反映體內(nèi)腫瘤狀態(tài)，是臨床應(yīng)用最廣泛的液體活檢生物標(biāo)志物之一^[6]。

ctDNA中體細(xì)胞突變的等位基因頻率（VAF）很低，即便在晚期/轉(zhuǎn)移性癌癥（III/IV期）中，平均VAF為3.67%，中位VAF僅為0.41%^[7]，因此需要較高的測序深度才能有效提高變異檢出的靈敏度^[6]。由于HPV是絕大多數(shù)宮頸癌的病因，并且在細(xì)胞中以多個(gè)拷貝形式存在，因此也應(yīng)以ctDNA的形式釋放，它是一種潛在的生物標(biāo)志物^[2]。ctHPV在總cfDNA中不受高野生型背景的干擾，比點(diǎn)突變更容易檢測和鑒別，且無需定制化流程。

 ▲宮頸癌ctHPV檢測的概覽^[2]

ctHPV檢測在宮頸癌中的應(yīng)用

PAIR-HPV前瞻性研究（NCT02554565）納入了55例根治性放化療（CRT）一線治療的患者，主要為II-IVA期。在CRT治療前，69%的患者成功檢測到HPV ctDNA。HPV ctDNA水平與腫瘤中HPV拷貝數(shù)（r=0.41，p<0.001），腫瘤分期（p=0.037）和淋巴結(jié)狀態(tài)（p=0.02）相關(guān)。CRT結(jié)束時(shí)和隨訪期間，HPV ctDNA陽性與較低的無病生存（DFS，p=0.048）和總生存（OS，p=0.0013）相關(guān)^[8]。

 ▲ctHPV檢測結(jié)果提示患者預(yù)后^[8]

BioRAID研究（NCT02428842）入組了419例患者，94例納入無進(jìn)展生存（PFS）分析。73%的患者為FIGO III/IV期，均為16/18型，其中20%手術(shù)，65%放化療，15%新輔治療。研究采用HPV E7基因作為標(biāo)志物。在治療前，63%的患者檢測到HPV ctDNA。HPV ctDNA陽性與FIGO高分期（p=0.02）和主動(dòng)脈旁淋巴結(jié)受累（p= 0.01）相關(guān)。HPV ctDNA水平與腫瘤中HPV 拷貝數(shù)呈正相關(guān)（r=0.39，p<0.001）^[9]。

研究發(fā)現(xiàn)基線時(shí)的HPV ctDNA檢測結(jié)果與PFS無關(guān)（HR=1.59；p=0.19）；治療后HPV ctDNA陽性與更短的PFS相關(guān)（p<0.0001）。44例隨訪患者，取治療結(jié)束時(shí)（EOT）/隨訪過程樣本進(jìn)行監(jiān)測。除一例患者以外，EOT ctHPV陰性患者在隨訪期間保持陰性。75%的EOT ctHPV陽性患者的在隨訪期間仍為陽性，且全部復(fù)發(fā)；2例隨訪期間清除ctHPV的患者未復(fù)發(fā)。ctHPV檢出陽性較臨床確診復(fù)發(fā)的中位提前時(shí)間為10個(gè)月（2~15個(gè)月）^[9]。

 ▲ctHPV檢測結(jié)果與患者PFS的關(guān)系（A、基線檢測，B、EOT檢測）^[9]

 ▲從EOT到隨訪結(jié)束，ctHPV的監(jiān)測結(jié)果^[9]

瑞典的一項(xiàng)研究納入74例局部晚期宮頸癌患者，采用數(shù)字PCR（ddPCR）的方法分析了418個(gè)血漿樣本，中位隨訪時(shí)間為37個(gè)月。92.4%的治療前樣本ctHPV陽性。血漿中持續(xù)存在的ctHPV與較差的PFS相關(guān)（P < 0.001）。早期隨訪時(shí)ctHPV狀態(tài)預(yù)測疾病進(jìn)展的陽性預(yù)測值（PPV）為87.5%，陰性預(yù)測值（NPV）為89.3%。在所有（10例）完全應(yīng)答后復(fù)發(fā)的患者中，ctHPV檢出陽性較影像學(xué)診斷復(fù)發(fā)的中位提前時(shí)間為315天^[10]。

ctHPV檢測在口咽癌中的應(yīng)用

除宮頸癌以外，頭頸部鱗癌、肛門癌、陰道癌、外陰癌等癌種均有一定比例是由HPV感染所致。近年來，歐美國家口咽癌的發(fā)病率明顯上升，研究提示大部分與HPV感染具有直接關(guān)系。我國同樣有逐年升高的趨勢。基于一項(xiàng)針對HPV16檢測的meta分析，國內(nèi)頭頸部腫瘤的HPV16總體感染率為24.7%，口咽癌的比例為31.6%。近期一項(xiàng)基于WHO數(shù)據(jù)庫的研究顯示，中國HPV陽性口咽癌的比例為25.8%^[11]。

美國Naveris公司主導(dǎo)的研究（NCT02281955、NCT03077243、NCT0316182）分析了45例患者的509份血液樣本，中位隨訪時(shí)間為19.2個(gè)月。37例患者在治療后所有時(shí)間點(diǎn)均未檢測到ctHPV，無患者復(fù)發(fā)，NPV為100%。8例患者在治療后監(jiān)測期間出現(xiàn)ctHPV陽性，其中4例被活檢證實(shí)復(fù)發(fā)。這4例患者連續(xù)2次ctHPV陽性，PPV為100%。ctHPV陽性與活檢證實(shí)復(fù)發(fā)之間的中位提前時(shí)間為6.6個(gè)月（3.3-12.9個(gè)月）^[12]。

 ▲連續(xù)2次ctHPV監(jiān)測異常的患者復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)更高^[12]

 ▲ctHPV監(jiān)測有助于早期發(fā)現(xiàn)疾病復(fù)發(fā)^[12]

日本的一項(xiàng)研究在35例接受放療聯(lián)合或不聯(lián)合化療的HPV16相關(guān)頭頸部鱗癌患者中使ddPCR定量檢測ctHPV16 DNA。中位隨訪21個(gè)月后，ctHPV16 DNA和PET-CT的NPV相似（89.7% vs 84.0%），而ctHPV16 DNA的PPV遠(yuǎn)高于PET-CT（100% vs 50.0%）^[13]。CSCO頭頸部腫瘤診療指南也在注釋中提到“對于HPV相關(guān)的口咽癌，近期有研究顯示治療后定期進(jìn)行外周血HPV DNA的拷貝數(shù)（檢測）有助于早期發(fā)現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)”^[11]。相信這一監(jiān)測方案不久之后會(huì)被寫入指南。

ctHPV的檢測方法和注意事項(xiàng)

早期的ctHPV研究都有一個(gè)共同點(diǎn)，即靈敏度相當(dāng)差，大多數(shù)僅為6.9%~30%。原因可能是多方面的。熒光定量PCR（qPCR）的方法不夠靈敏，無法檢測微量的ctHPV。血漿樣本的采樣量、保存、處理方法對檢測結(jié)果亦有影響^[2]。2016年，Jeannot等人發(fā)表了第一項(xiàng)使用ddPCR檢測血漿中ctHPV DNA的研究。在47例HPV16/18陽性的宮頸癌患者中，他們使用ddPCR（16/18 E7）在83%的病例的治療前血漿中發(fā)現(xiàn)了ctHPV DNA，而使用qPCR時(shí)，這一比例僅為60%（p=0.02）^[14]。

靶向HPV的高通量測序（HPV-seq）也是可選的方法之一。研究發(fā)現(xiàn)HPV-seq（靶向HPV和鱗癌中12個(gè)高頻突變基因）在細(xì)胞系數(shù)據(jù)中重現(xiàn)了小于0.6拷貝水平的檢測限。HPV-seq與ddPCR結(jié)果具有高度一致性（r²=0.95，p=1.9×10^-29）。HPV-seq可以檢測出ddPCR檢測陰性的、治療后低至0.03拷貝/mL血漿中的ctDNA。治療結(jié)束時(shí)HPV ctDNA陽性與較差的PFS相關(guān)，檢測復(fù)發(fā)的敏感性為100%，特異性為67%（ddPCR法均為75%）^[15]。

前瞻性、多中心驗(yàn)證研究（NCT03853915、NCT03702309）納入了70接受CRT治療的IB-IVA期宮頸癌患者。分別在基線時(shí)、CRT結(jié)束時(shí)、CRT后4~6周和CRT后3個(gè)月采集患者的外周血，同時(shí)使用ddPCR和HPV-seq兩種方法檢測ctHPV水平。主要終點(diǎn)為2年的PFS率，中位隨訪時(shí)間為2.2年，70例HPV陽性宮頸癌患者中有24例PFS事件。HPV-seq顯示出與ddPCR相似的結(jié)果。與ctHPV陰性的患者相比，在CRT結(jié)束時(shí)、CRT后4~6周和CRT后3個(gè)月，ctHPV陽性的患者2年的PFS顯著更差。無論采用ddPCR還是HPV-seq，與影像學(xué)相比，發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)的中位提前時(shí)間為5.9個(gè)月^[16]。

▲這兩種檢測方法一致顯示：ctHPV快速清除的患者，具有更好的PFS，其次是逐漸清除的患者；而ctHPV升高的患者，PFS顯著更差^[16]。

需要注意的是，ctHPV定量檢測不適用于健康女性或癌前病變患者的篩查。9項(xiàng)采用qPCR法的研究和最近幾項(xiàng)基于ddPCR法的研究均未在癌前病變患者血漿中檢出ctHPV；唯一檢出的研究中，血漿中的HPV狀態(tài)與宮頸樣本的相關(guān)性相當(dāng)差（44%）。大多數(shù)在健康女性中使用qPCR或ddPCR檢測ctHPV的檢出率僅為0%至2%。ctHPV在早期患者中的陽性率也較低，I~II期宮頸癌患者基線ctHPV陽性率為24.1~65%；晚期（III~IV期）患者基線ctHPV陽性率可達(dá)到63~100%^[2]。

總結(jié)

ctHPV檢測的是整合到人類基因組，并釋放到血漿中的HPV游離DNA的E6/E7基因，用于分子殘留病灶（MRD）檢測，可以輔助預(yù)測治療效果，更可提早數(shù)月提示疾病復(fù)發(fā)。飛朔生物的人ctHPV16/18型定量檢測采用數(shù)字PCR法，靈敏度可達(dá)到1-3拷貝/反應(yīng)，而且實(shí)驗(yàn)操作簡便，報(bào)告周期短。飛朔生物致力于為腫瘤個(gè)體化精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)檢測提供最具創(chuàng)新性的產(chǎn)品和服務(wù)，并持續(xù)更新現(xiàn)有產(chǎn)品。

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